定义
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）,简称qPCR，是一种在DNA扩增体系中加入荧光基团，通过聚合酶链式反应（PCR）循环实现荧光信号的积累，从而实时检测每次PCR循环后产物总量的一种方法，是核酸检测和定量分析的“金标准”。

化学原理
实时荧光定量PCR根据所使用的荧光化学可分为两种：荧光染料(SYBR Green I染料)和荧光探针(TaqMan探针)。

1.荧光染料（非特异性标记）
SYBR Green I染料是一种结合于所有双联DNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。这种染料在反应体系中处于游离状态时，发出的荧光极其微弱，但当其与DNA双链结合的时候，荧光信号就会被放大，从而被仪器所检测。在PCR实验中，染料的结合量与DNA双链的浓度呈现正比关系，所以我们可以通过检测荧光信号的强度来反应PCR体系中DNA的浓度。

优点：可用于监测任何双链 DNA 序列的扩增，无需单独设计探针，操作简单成本较低。


2.荧光探针（特异性标记）
TaqMan荧光探针是进行荧光检测的另外一种方法。TaqMan荧光探针是由5’端的荧光报告基团、3’端的荧光淬灭基团和靶基因特异性结合的序列构成。当探针在反应体系中处于游离状态时，荧光报告基团的信号会被荧光淬灭基团所吸收，但当PCR进行到退火、延伸阶段时，DNA聚合酶会将荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而发出荧光，因此探针法也可以通过检测荧光信号的强度来反应PCR体系中DNA的浓度。


优点：
①荧光探针只与目的序列结合，具有良好的特异性，无须实验优化
②不同波长的荧光报告基团可以标记不同的探针，兼容多重反应

常见术语

CT值：C代表Cycle，T代表Threshold，即指qPCR在扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数。
扩增曲线：Amplification curve ，随着PCR反应的进行，荧光信号强度随着扩增产物的增加逐渐增强，通过荧光强度来检测扩增产物的变化。
阈值：Threshold，自动设置是3-15个循环的荧光信号平均值的标准偏差的10倍，也是基线标准偏差的10倍。
惰性参比染料（ROX）：用作荧光信号标准化内部参照，可以逐孔校正因移液不准确、孔位置及荧光波动造成的变动。
溶解曲线：Melting curve，是指扩增反应结束后，对双链DNA进行升温处理，此时，DNA双链逐渐解开，染料脱落，荧光值下降，荧光值随温度变化的曲线即“溶解曲线”，可用来判断体系中是否含有引物二聚体和非特异性扩增。
扩增效率：一个DNA分子扩增为2个DNA分子，这种情况下的扩增效率为100%。实际上会出现偏高和偏低的情况，90-110%之间。
NTC：无模板对照（No template control），是指扩增反应中，模板通常用水来代替，用于检测试剂污染或外源DNA造成的污染。

实验操作步骤

1实验试剂耗材的准备:包括DNA模板、引物、qPCR mix、ddH2O、qPCR仪、移液枪、无酶枪头等。
2配制qPCR反应体系，用枪头轻轻混匀。

组分	体积（μL）	体积（μL）	终浓度
qPCR酶	10	25	1×
引物F	0.4	1	0.2μM
引物R	0.4	1	0.2μM
模板DNA	X	X	/
ddH2O	补足至20	补足至50	/

注：
①推荐在冰上配制qPCR反应体系。
②引物浓度通常为0.2μM，可根据实验实际情况进行调整。
③推荐使用20或50μL的反应体系，可保证扩增的有效性。
④如果模板DNA为未稀释的原液，建议使用体积不超过反应体系体积的1/10。

3上机反应：上机前设置样本信息和程序，上机前的样品需轻微离心，避免气泡，加完样品后，立马上机。

4导出数据
实验分析：常见的计算公式包括：△CT= CT（目的基因）- CT（内参基因）；△△ CT= △CT（实验组）- △CT（对照组）；RQ=2^-△△CT