干货分享 | Pull Down试剂盒常见问题解答缩略图

干货分享 | Pull Down试剂盒常见问题解答

产品介绍

His/GST Protein Pull Down Kit是体外检测蛋白质之间直接互作的有效方法,通过将带有His标签/GST标签的“诱饵蛋白”固定在固相基质上,从细胞裂解液等混合样品中,捕获有互作关系的“靶蛋白”,是伯仪互作系列产品的新成员。

常见问题解答

问:产品说明书中标注的规格,是填料含量还是总体积?

答:填料跟保护液的体积比各占50%。填料是在保护液里的,保护液和填料的比例是1:1,说明书中标注的,以5T为例,写的是0.15ml,这个0.15是填料的体积,但实际到手的是0.3ml的试剂。

问:试剂盒中的4FF试剂,用了两三次,就吸不上来了,没法摇匀的原因?

答:填料被吸干了,可能在用之前没有进行混匀,可以加适量填料保护液(PBS+20%乙醇。) 静置一晚上观察填料占总溶液的百分比,根据填料体积和保护液体积比为1:1加入适量的体积的填料。

问:表达的蛋白裂解完,可以直接用上清去做pull down吗?

答:是的,可以不做纯化,去做pull down的。

问:阴性对照怎么设置?

答:填料+与目的蛋白不结合的诱饵蛋白+目的蛋白。

注意事项

1.磁珠填料应保存在储存溶液中,防止干燥,使用前请充分混匀。
2.如果需要在还原条件下洗脱,向 1× 电泳上样缓冲液中加入DTT(终浓度 10-20mM)。
3.经煮沸后的填料失去结合能力,经煮沸的填料不应再次使用。
4.为保证最佳的实验结果,请选择较纯的诱饵蛋白进行蛋白互作。
5.对于蛋白互作实验,不同类的诱饵蛋白与靶蛋白结合的亲和性是有区别的,因此若本试剂盒提供的缓冲体系不能获得很好的实验结果,可自行优化缓冲液进行实验。
6.实验设计时,建议加入对照组,以备后续实验结果分析。
7.在确定实验结果前,建议保留各步骤的样品以备验证(如 input、流穿、洗杂、洗脱、煮球)。
8.配套的 Pull-down Column Accessory 附有两个规格的垫片,当使用微量介质(10-50μl)进行实验时,请按图一装入垫片,当使用大量介质(>100μl)进行实验时,请按图二装入垫片。

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