干货分享 | IP/CoIP试剂盒常见问题及注意事项

产品介绍

rProtein A/G Magnetic IP/Co-IP Kit 是一款能够高效完成免疫沉淀(IP)及免疫共沉淀(Co-IP)实验的试剂盒。其包含高性能 rProtein A/G MagPoly Beads,能够实现快速便捷的磁性分离。另外试剂盒内经过优化的缓冲液,为免疫沉淀实验提供了良好的反应条件,增强了免疫沉淀实验的稳定性。聚合物磁珠的配体是重组蛋白 A/G(约 14 kDa),同时拥有蛋白 A 和蛋白 G 的 IgG 结合结构域,具有更广的抗体亚型结合范围。试剂盒的洗脱方式多样,既可以用低 pH 的洗脱液将免疫复合物从蛋白 A/G 磁珠上洗脱,也可以使用电泳上样缓冲液以变性条件洗脱免疫复合物,直接进行后续检测分析。

常见问题解答

1.试剂盒中,各组分的用途是什么?

rProtein A/G MagPoly Beads是磁珠,吸附抗体;

Lysis/Washing Buffer(5x)是缓冲液,使用前需用超纯水稀释到1x;

Lysis/Washing Buffer Enhanced是含去污剂的缓冲液,根据实验需求进行选择使用;

Elution Buffer是洗脱液;

Neutralization Buffer是中和液,选择低pH洗脱时会用到。

2.Lysis/Wash Buffer Enhanced终浓度是0.1%-1%,对于终浓度的选择有参考依据吗?

Enhanced用于细胞裂解时,终浓度选择1%;用于磁珠漂洗时,终浓度选择0.1%-0.5%。

3.什么是IgG阴性对照、设置阴性对照的意义是什么?

IgG阴性对照是作为与IP捕获抗体实验组相对应的阴性对照组,理论上IgG并不能特异性的与任何蛋白结合,可选用与IP捕获抗体相同物种来源的同型IgG作为阴性对照。设置阴性对照可以用于排除样本中非特异性与IgG结合的蛋白,消除样本背景,排除假阳性。

4.IgG阴性对照如何使用?

IgG作为一个独立的对照组(是IP一抗的对照)需要做与实验组完全相同的操作。简单来讲就是把它当作我们的IP捕获抗体去做整个IP实验流程,在后续的WB检测时,其IP产物作为一个独立样本同实验组IP产物一同进行上样检测。

5.什么是Input阳性对照?

免疫共沉淀实验中,会直接取细胞裂解液进行WB,用于验证细胞裂解液中确实存在目的蛋白。

6.说明书中,材料准备里面的二硫苏糖醇和蛋白酶抑制剂在哪里使用?

二硫苏糖醇(DTT)是还原剂,是加在loading buffer里面的,根据选用loading buffer的类型来进行选择添加;

蛋白酶抑制剂是为了防止蛋白降解,加在细胞裂解液中,根据实验需要进行选择添加。

7.变性洗脱和低pH洗脱的目的是不是不一样,哪种方案相对好一点?

低pH洗脱后,样品需要中和且蛋白有活性,洗脱体积较大,可以对蛋白做多种分析,比如质谱等检测,如果样品浓度低可能不方便后面分析;

变性洗脱(金属浴加热)会使蛋白失活,得到的样品可以直接跑电泳,一般只用于WB检测,能将磁珠上的蛋白都洗下来。

如果后面只进行WB试验,推荐变性洗脱。

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