干货分享|rProteinA/G免疫沉淀试剂盒常见问题解答

 

常见问题 问题解答
试剂盒组分中有蛋白酶抑制剂的成分吗? 试剂盒中没有提供蛋白酶抑制剂,需要使用的话,可以额外添加。
能做组织样本吗,也可以用试剂盒里的裂解液吗? 可以的做组织样本,使用ripa(弱)做裂解,后续操作都一样。
试剂盒里面的磁珠,漂洗之后可以反复用吗? 不建议重复使用。
5x Lysis/Wash Buffer用什么稀释? 超纯水。
buffer Enhanced的浓度推荐? Enhanced用于细胞裂解时,终浓度选择1%;用于磁珠漂洗时,终浓度选择0.1%-0.5% ,也可以配制0.5%用于全过程。
一次实验需要准备多少样品量? 一次实验亲和微球的用量是20ul,能结合的抗体量是5ug左右,细胞裂解液的体积在200-500ul。细胞量的选择及裂解浓度在说明书中有详细介绍。
抗体和磁珠和蛋白上清孵育磁珠成团了? ①因为磁珠上结合的蛋白,这些蛋白与蛋白之间的相互作用把磁珠连在一起,产生了聚集,用移液器进行多次吹打,可以继续进行后面的实验
②若裂解液中含有的核酸之类的杂质,磁珠易形成结团,可以在裂解时加入一些超级核酸酶。
打质谱,是需要跑完电泳送胶条去打质谱? 有2种方式,一种是方案一洗脱结束后,把洗脱产物直接拿去打质谱,另一种是方案一洗脱结束后,加loading煮样离心跑胶,切胶去打质谱。
IP做完后,用考染看不到条带? ip的结果检测,需要用WB去检测的,WB的检测灵敏度在ng级,用ECL显色法理论上可达pg级,而考染的检测灵敏度在ug级。所以同样的样品,WB可以看到条带,但考染看不到
Input上有目的条带,为什么实验组没有明显条带? ①抗体未结合在亲和微球上,建议按方案一操作,增加抗体与微球的孵育时间。
②抗原未与抗体结合,用1×IP Lysis/Wash Buffer 稀释裂解后的样品来降低去污剂的浓度,同时增加孵育时间。
注:孵育时需要让亲和微球在样品溶液中保持悬浮状态,微球沉底也会对结合效率有影响。
③洗脱不彻底,选择变性洗脱方式。
微球是不是有非特异性吸附,WB的背景非常深? 亲和微球的非特异性吸附可以通过增加清洗微球的1×IP Lysis/Wash Buffer(Enhanced)体积,或者是在磁珠漂洗步骤更换新EP管来优化。WB背景深可能是在一抗二抗孵育后清洗步骤不彻底造成的,可以适当提高清洗时摇床的转速,奶粉溶液也需要提前配制,充分溶解。
目的蛋白条带和抗体的重链/轻链分子量接近,WB上无法判断? 一般IP实验中的抗体和WB实验中的一抗要选择不同种属的抗体,这样才能避免曝光出抗体条带;如果选择同一种属的抗体,WB实验中的二抗也可选择避免轻链/重链的二抗。
洗脱组分中没有目的抗原 可能原因①:蛋白可能是包涵体,没有在上清中
解决办法:可以通过电泳检测裂解液分析上清中是否含有目的蛋白,包涵体蛋白需要按照包涵体蛋白的纯化方式
②表达量太低
解决办法:优化表达条件
③洗脱条件过于温和
解决办法:①延长洗脱孵育时间②使用强度更高的洗脱液

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