| 常见问题 | 问题解答 |
| 试剂盒组分中有蛋白酶抑制剂的成分吗？ | 试剂盒中没有提供蛋白酶抑制剂，需要使用的话，可以额外添加。 |
| 能做组织样本吗，也可以用试剂盒里的裂解液吗？ | 可以的做组织样本，使用ripa（弱）做裂解，后续操作都一样。 |
| 试剂盒里面的磁珠，漂洗之后可以反复用吗？ | 不建议重复使用。 |
| 5x Lysis/Wash Buffer用什么稀释？ | 超纯水。 |
| buffer Enhanced的浓度推荐？ | Enhanced用于细胞裂解时，终浓度选择1%；用于磁珠漂洗时，终浓度选择0.1%-0.5% ，也可以配制0.5%用于全过程。 |
| 一次实验需要准备多少样品量？ | 一次实验亲和微球的用量是20ul，能结合的抗体量是5ug左右，细胞裂解液的体积在200-500ul。细胞量的选择及裂解浓度在说明书中有详细介绍。 |
| 抗体和磁珠和蛋白上清孵育磁珠成团了？ | ①因为磁珠上结合的蛋白，这些蛋白与蛋白之间的相互作用把磁珠连在一起，产生了聚集，用移液器进行多次吹打，可以继续进行后面的实验 ②若裂解液中含有的核酸之类的杂质，磁珠易形成结团，可以在裂解时加入一些超级核酸酶。 |
| 打质谱，是需要跑完电泳送胶条去打质谱？ | 有2种方式，一种是方案一洗脱结束后，把洗脱产物直接拿去打质谱，另一种是方案一洗脱结束后，加loading煮样离心跑胶，切胶去打质谱。 |
| IP做完后，用考染看不到条带？ | ip的结果检测，需要用WB去检测的，WB的检测灵敏度在ng级，用ECL显色法理论上可达pg级，而考染的检测灵敏度在ug级。所以同样的样品，WB可以看到条带，但考染看不到 |
| Input上有目的条带，为什么实验组没有明显条带？ | ①抗体未结合在亲和微球上，建议按方案一操作，增加抗体与微球的孵育时间。 ②抗原未与抗体结合，用1×IP Lysis/Wash Buffer 稀释裂解后的样品来降低去污剂的浓度，同时增加孵育时间。 注：孵育时需要让亲和微球在样品溶液中保持悬浮状态，微球沉底也会对结合效率有影响。 ③洗脱不彻底，选择变性洗脱方式。 |
| 微球是不是有非特异性吸附，WB的背景非常深？ | 亲和微球的非特异性吸附可以通过增加清洗微球的1×IP Lysis/Wash Buffer(Enhanced)体积，或者是在磁珠漂洗步骤更换新EP管来优化。WB背景深可能是在一抗二抗孵育后清洗步骤不彻底造成的，可以适当提高清洗时摇床的转速，奶粉溶液也需要提前配制，充分溶解。 |
| 目的蛋白条带和抗体的重链/轻链分子量接近，WB上无法判断？ | 一般IP实验中的抗体和WB实验中的一抗要选择不同种属的抗体，这样才能避免曝光出抗体条带；如果选择同一种属的抗体，WB实验中的二抗也可选择避免轻链/重链的二抗。 |
| 洗脱组分中没有目的抗原 | 可能原因①：蛋白可能是包涵体，没有在上清中 解决办法：可以通过电泳检测裂解液分析上清中是否含有目的蛋白，包涵体蛋白需要按照包涵体蛋白的纯化方式 ②表达量太低 解决办法：优化表达条件 ③洗脱条件过于温和 解决办法：①延长洗脱孵育时间②使用强度更高的洗脱液 |
