干货分享 | 答疑解惑—ACE免疫沉淀/免疫共沉淀试剂盒

小白必看——实验操作详解

图1.不同基质微球的对比

Q2：说明书上提供了两种实验方案，我该如何选择？

免疫沉淀（IP）主要针对的是纯化单一抗原的实验。抗原-抗体复合物的组合既可以分步进行， 也可以一步完成。下面提供两种常用的孵育方案：

方案一，先将抗体和样品 ( 如细胞裂解物 ) 混合孵育， 然后加入亲和用微球， 结合抗体-抗原复合物。

方案二，先将抗体和亲和微球先进行孵育结合，然后加入含有抗原的样本，依靠亲和微球-抗体复合物来捕获目标抗原。

图2. 两种方案IP操作流程示意图

Q3：我要做Co-IP实验，说明书中只介绍了IP操作的步骤，我应该怎么做？

免疫共沉淀分析（Co-IP）与IP十分相似，实验的方案和基本流程与IP相同，当制备好亲和微球-抗体-抗原复合物后，可以加入待测样品混合孵育，基本上所有IP的体系均可以用于 Co-IP。

Q4：一次实验需要准备多少样品量？

一次实验亲和微球的用量是20ul，能结合的抗体量是5ug左右，细胞裂解液的体积在200-500ul。细胞量的选择及裂解浓度在说明书中有详细介绍。

Q5：酸性洗脱和变性洗脱有什么区别？

酸性洗脱后立即中和，对获得的目的蛋白活性影响较小，除可以用于SDS-PAGE实验，也可用于质谱等分析实验。

变性洗脱获得的蛋白失活，一般只用于SDS-PAGE实验及后续银染或者WB等验证。注：不同洗脱方式获得样品状态见上图2。

Q1：我的input上有目的蛋白，为什么实验组没有明显条带？(下图3）

图3

实验组没有目的蛋白可能有以下几个原因：

1. 抗体未结合在亲和微球上，建议按方案一操作，增加抗体与微球的孵育时间。

2. 抗原未与抗体结合，用1×IP Lysis/Wash Buffer 稀释裂解后的样品来降低去污剂的浓度，同时增加孵育时间。

注：孵育时需要让亲和微球在样品溶液中保持悬浮状态，微球沉底也会对结合效率有影响。

3. 洗脱不彻底，选择变性洗脱方式。

Q2：微球是不是有非特异性吸附，WB的背景非常深？（下图4）

图4

亲和微球的非特异性吸附可以通过增加清洗微球的1×IP Lysis/Wash Buffer(Enhanced)体积，或者是在磁珠漂洗步骤更换新EP管来优化。

WB背景深可能是在一抗二抗孵育后清洗步骤不彻底造成的，可以适当提高清洗时摇床的转速，7.5%奶粉溶液也需要提前配制，充分溶解。

Q3：我的目的蛋白条带和抗体的重链/轻链分子量接近，WB上无法判断。

一般IP实验中的抗体和WB实验中的一抗要选择不同种属的抗体，这样才能避免曝光出抗体条带；如果选择同一种属的抗体，WB实验中的二抗也可选择避免轻链/重链的二抗。